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常见问题

高效液相色谱(HPLC)Q&A

基线漂移

  • 1. 柱温变化?
    解决办法:控制好柱子和流动相的温度,在检测器之前使用热交换器。
  • 2. 流动相不均匀?
    解决办法:使用HPLC级的溶剂,流动相在使用前进行脱气处理。
  • 3. 流动相配比不当或流速变化?
    解决办法:更改配比或流速,为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。
  • 4. 样品含有高保留的物质?
    解决办法:使用保护柱,如有必要,在进样之间或在分析过程中,定期用强溶剂冲洗柱子。
  • 5. 流通池被污染或有气体?
    解决办法:用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池,也可以用1N的硝酸,但不要用盐酸。
  • 6. 检测器没有设置在最大吸收波长处?
    解决办法:将波长改为最大吸收波长。
  • 7. 柱平衡慢,特别是流动相发生变化时?
    解决办法:用中等强度的溶剂进行冲洗,更改流动相时,在分析前用10~20倍体积的新流动相冲洗柱子。


基线噪音

  • 1. 漏液?
    解决办法:检查管路接头是否松动,泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要,更换泵密封。
  • 2. 柱温过高,检测器未加热?
    解决办法:使用柱温箱,减少温度差异或加上热交换器。
  • 3. 在流动相、检测器或泵中有空气?
    解决办法:流动相脱气,冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。
  • 4. 流动相混合不均匀?
    解决办法:用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂。
  • 5. 流通池被污染?
    解决办法:用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。
  • 6. 检测器记录仪电子元件故障?
    解决办法:断开检测器和记录仪的电源,检查并排除故障。


色谱峰前延

  • 1. 溶剂选择不合适?
    解决办法:使用流动相或者接近流动相比例作为溶剂。
  • 2. 被保留的样品在正常的出峰前陆续出现,形成前延锋?
    解决办法:减少进样量。
  • 3. 柱子温度过低?
    解决办法:升高柱子温度。
  • 4. 色谱柱损坏?
    解决办法:更换色谱柱。


色谱峰拖尾

  • 1. 柱超载?
    解决办法:减少进样量,增加柱直径采用较高容量的固定相。
  • 2. 流动相pH选择不恰当?
    解决办法:调整pH值。对于碱性物质,低pH值更有利于得到对称峰。
  • 3. 存在干扰峰?
    解决办法:1. 使用更长的色谱柱; 2. 改变流动相或更换色谱柱。
  • 4. 筛板堵塞?
    解决办法:1. 反冲色谱柱; 2. 更换筛板或色谱柱。
  • 5. 样品被污染?
    解决办法:1. 采用有机溶剂梯度洗涤1 h以上,以冲洗柱子;2. 更换色谱柱。


鬼峰

  • 1. 柱子未平衡?
    解决办法:重新平衡柱子,用流动相或接近流动相比例作为样品溶剂。
  • 2. 三氟乙酸氧化?
    解决办法:每天配制新鲜三氟乙酸,并加入抗氧化剂。
  • 3. 进样阀残余峰?
    解决办法:每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗。
  • 4. 水污染(反相)?
    解决办法:通过变化平衡时间检查水质量,用HPLC级的水。


峰展宽

  • 1. 数据系统采样速率太慢?
    解决办法:设定速率应是每峰大于10。
  • 2. 检测器时间常数过大?
    解决办法:设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%。
  • 3. 样品体积过大?
    解决办法:用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%。
  • 4. 保留时间过长?
    解决办法:等度洗脱时增加强溶剂含量,也可用梯度洗脱。
  • 5. 检测池体积过大?
    解决办法:用小体积池,卸下热交换器。
  • 6. 柱温变化?
    解决办法:增加柱温,采用低粘度流动相。
  • 7. 柱外体积过大?
    解决办法:将连接管径和连接管长度降至最小。
  • 8. 样品过载?
    解决办法:减少进样量或进低浓度的样品。


保留时间漂移

  • 1. 柱子未平衡?
    解决办法:重新平衡柱子。
  • 2. 温度控制不好?
    解决办法:采用恒温装置,保持柱温恒定。
  • 3. 流动相发生变化?
    解决办法:防止流动相发生蒸发、反应等。


保留时间快速变化

  • 1. 流动相不合适?
    解决办法:改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合。
  • 2. 流速发生变化?
    解决办法:重新设定流速,使之保持稳定。
  • 3. 泵中有气泡?
    解决办法:通过排气等操作将气泡赶出。


压力持续偏高

  • 1. 筛板堵塞?
    解决办法:1. 反冲色谱柱;2. 更换筛板或色谱柱。
  • 2. 进样阀损坏?
    解决办法:清洗或更换进样阀。
  • 3. 保护柱阻塞?
    解决办法:清洗或更换保护柱。
  • 4. 控制器故障?
    解决办法:修理或更换控制器。
  • 5. 在线过滤器阻塞?
    解决办法:清洗或更换在线过滤器。
  • 6. 柱温过低?
    解决办法:升高柱温。
  • 7. 流速设置过高?
    解决办法:及时调整流速。


灵敏度过低

  • 1. 检测器时间常数过大?
    解决办法:降低时间常数。
  • 2. 检测池中有气泡?
    解决办法:排除气泡。
  • 3. 检测器与样品不匹配?
    解决办法:根据样品的化学性质调整波长或更换检测器。
  • 4. 检测器与记录仪超出校正曲线?
    解决办法:检查检测器和记录仪,重新校正曲线。
  • 5. 记录仪测压范围不合适?
    解决办法:调整电压范围。
  • 6. 样品量不足?
    解决办法:增加样品进样量。
  • 7. 样品未从柱子中流出?
    解决办法:根据样品的化学性质改变流动相或柱子。


梯度洗脱

  • 1. 什么是梯度洗脱?
    梯度洗脱就是在分离过程中由几种不同极性的溶剂组成流动相,通过改变流动相中各溶剂的组成比例从而改变流动相的极性,使每个流出的组分都有合适的容量因子k,从而达到提高分离效果和缩短分析时间的目的。
  • 2. 什么情况下要进行梯度洗脱 ?
    (1)具有较宽k值范围的多种样品分析;
    (2)相对分子质量≥1000的大分子样品分析;
    (3)样品含有高保留的干扰组分,一次分析完成后进行梯度洗脱,将干扰组分洗脱出去,以免其影响下一次分析;
    (4)对于不清楚使用哪种洗脱方式的情况,可以使用梯度洗脱,找到其较优的洗脱条件。
  • 3. 梯度洗脱应注意哪些问题?
    (1)注意溶剂的互溶性,不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。有些溶剂在一定比例内混溶,超出一定范围后就不互溶,尤其在使用缓冲盐时需特别小心;
    (2)梯度洗脱所用的溶剂纯度要求高,以保证良好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱,以辨认溶剂杂质峰,因为弱溶剂中的杂质富集在液相色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来;
    (3)用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气,以防止混合时产生气泡;
    (4)每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行处理,使固定相与初始流动相达到完全平衡。


液相色谱与质谱联用(LC-MS)Q&A

基线背景太高

  • 1. 离子源雾化室不干净?
    解决办法:清洗雾化室。
  • 2. ESI源不干净?
    解决办法:更换喷针并清洗。
  • 3. 流动相不新鲜或不干净?
    解决办法:更换新鲜流动相。
  • 4. 配管脏?
    解决办法:更换新配管。
  • 5. DL管脏?
    解决办法:更换DL管。


吸收峰宽

  • 1. 配管内径过大?
    解决办法:调整配管内径为0.13 mm。
  • 2. 配管区域中有死体积?
    解决办法:重新连接配管。
  • 3. 配管切割面倾斜?
    解决办法:更换配管。
  • 4. 离子源位置偏移过大?
    解决办法:调整离子源位置。


离子强度不稳定或偏低

  • 1. 没有连接高压电源?
    解决办法:使用高压电源。
  • 2. DL管不干净或堵塞?
    解决办法:更换DL管。
  • 3. 离子源电流过高?
    解决办法:降低接口电压。
  • 4. ESI毛细管喷针堵塞?
    解决办法:更换毛细管喷针。
  • 5. ESI毛细管喷针超出离子源过长或陷入离子源中?
    解决办法:调整喷针位置。
  • 6. ESI离子源位置偏移?
    解决办法:调整离子源位置。


信号、噪音、正负离子模式

  • 1. 信号不稳定?
    解决办法:
    1. 保证干燥用气流和温度对溶剂流动是正确的;
    2. 保证溶剂彻底脱气;
    3. 保证LC反压稳定;
    4. 保证指示溶剂流动稳定。
  • 2. 高质谱噪音?
    解决办法:
    1. 采用合适的质量过滤器值;
    2. 检查喷雾形状;雾化器可能损坏或放置不当;
    3. 保证LC反压稳定;指示溶剂流动稳定;
    4. 保证干燥用气流和温度对溶剂流动是正确的;
    5. 保证溶剂彻底脱气;
    6. 保证流动相中的水是去离子水(>18MW)。
  • 3. 如何选择正负离子模式?
    ◆ 正离子模式:适用于碱性样品,可以用甲酸或乙酸加以酸化。当样品中含有仲氮或叔氮时,可优先考虑使用正离子模式。
    ◆ 负离子模式:适合于酸性样品,可用氮水或三乙胺加以碱化。当样品中含有较多的强扶电性基团,可使用负离子模式
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