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TCA循环系列

三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle)是需氧生物体内普遍存在的代谢途径,分布在线粒体。因为在这个循环中几个主要的中间代谢物是含有三个羧基的有机酸,所以称为三羧酸循环,又称为柠檬酸循环或者是TCA循环;也以发现者Hans Adolf Krebs命名为Krebs循环。三羧酸循环是三大营养素(糖类、脂类、氨基酸)的最终代谢通路,又是糖类、脂类、氨基酸代谢联系的枢纽。

三羧酸循环代谢物含量变化


三羧酸循环代谢物含量变化


迪信泰检测平台使用高效液相色谱的方法,使用Agilent 1260 Infinity型高效液相色谱仪对样品进行分离,DAD检测器鉴定,该方法可以高效、精准的检测三羧酸循环代谢物的含量变化。目前可检测的三羧酸循环代谢物包括柠檬酸、丙酮酸和琥珀酸酸等。对于常见三羧酸循环代谢物或以上三羧酸循环代谢的同类物质,可配合标样进行检测,对于稀有的三羧酸循环代谢物,如提供标准样品,可提供定制检测。对于在三羧酸循环过程中的酶类物质,结合相应的试剂盒采用生化法检测,以满足您的不同需求。

样品制备

三羧酸循环代谢物提取方法(此部分涉及到公司的核心工艺,以下仅为常规提取工艺)

1) 取10 mL左右的样品;
2) 5℃,12000rpm离心10 min;
3) 取上清;
4) 0.45 μm的微孔滤膜过滤,用HPLC检测。

迪信泰检测平台可检测三羧酸循环类项目

柠檬酸(CA)含量检测

测定意义:柠檬酸分子式为C6H8O7,也称为枸橼酸,是目前世界上产量最大的有机酸之一,应用十分广泛,常用于医药、化学工业、食品工业、石油工业、纺织、皮革、摄影、铸造、电子、塑料、建筑、陶瓷等工业领域中。

测定原理:柠檬酸的折光率与所需流动相的折光率存在差异,可以利用示差折光率检测器(RID)检测,柠檬酸可利用高效液相色谱(HPLC)进行定量分析。

柠檬酸分子结构式

柠檬酸分子结构式


异柠檬酸含量检测

测定意义:异柠檬酸分子式为C6H8O7,也称为1-羟-1,2,3-丙三甲酸,是柠檬酸的异构体,广泛存在于生物界中,在落地生根属等多汁植物的叶、或悬钩子类中特别多,其中生物能够利用的是D型。异柠檬酸也是三羧酸循环中的中间代谢产物,由柠檬酸在乌头酸酶的作用下可逆地生成异柠檬酸和顺乌头酸。

测定原理:异柠檬酸可利用高效液相色谱(HPLC)进行定量分析。

异柠檬酸分子结构式

异柠檬酸分子结构式


丙酮酸(PA)含量检测

测定意义:丙酮酸是动植物体内生化反应的底物、产物或中间产物,是一种重要的生化物质。测定丙酮酸的方法种类较多,常用的有荧光法、光度法、生物传感器法、化学发光法、色谱法等。

测定原理:丙酮酸在215nm紫外下有吸收,可利用高效液相色谱(HPLC)进行定量分析。

乳酸(LA)含量检测

测定意义:乳酸是一种天然有机酸,在人体内直接参与代谢循环,并迅速转化为肝糖,其能量转换速度比葡萄糖快六倍,起着调节肌肉活力和抗疲劳的作用。乳酸及其盐类在医药、农业、工业等部门中有广泛用途。常用的乳酸测定方法有滴定法、EDTA钙法、分光光度法、毛细管电泳法、气相色谱法、高效液相色谱法、离子色谱法、原子吸收法、酶分析法、酶电极法等。

测定原理:乳酸可利用高效液相色谱(HPLC)进行定量分析。

线粒体柠檬酸(MCA)含量检测

测定意义:线粒体柠檬酸是线粒体三羧酸循环的第一个中间产物,由柠檬酸合酶催化乙酰CoA与草酰乙酸合成,其含量是三羧酸循环强度的主要指标之一。

测定原理:线粒体柠檬酸在柠檬酸裂解酶的作用下,生成α-酮酸(草酰乙酸);在弱酸性条件下,α-酮酸进一步与苯肼反应,生成相应的α-酮酸苯腙;α-酮酸苯腙在330nm处有吸收峰,该波长下吸光度的变化程度可反映出线粒体柠檬酸的含量。

乙酰辅酶A活性检测

测定意义:乙酰辅酶A是物质和能量代谢的重要物质,在微生物体内发挥着碳代谢的中心枢纽作用,在三羧酸循环、脂类代谢、氨基酸代谢和萜类代谢等数百个生化反应中起着关键性的作用。

测定原理:苹果酸脱氢酶可催化苹果酸和NAD生成草酰乙酸和NADH。柠檬酸合酶可催化乙酰辅酶A和草酰乙酸生成柠檬酸和辅酶A。利用苹果酸脱氢酶和柠檬酸合酶的偶联反应,乙酰辅酶A含量和NADH的生成速率成正比,340nm下吸光值的上升速率反应了乙酰辅酶A含量的高低。

线粒体异柠檬酸脱氢酶(ICDHm) 活性检测

测定意义:异柠檬酸脱氢酶是存在于脑组织中的线粒体酶,在三羧酸循环、能量代谢、神经递质代谢等诸多生理及病理过程中发挥重要作用。酶活性的降低与诸多神经系统退行性疾病有关。

测定原理:ICDHm催化NAD+ 还原生成NADH,导致340nm处光吸收上升。

α-酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)活性检测

测定意义:α-酮戊二酸脱氢酶复合体是三羧酸循环中催化α-酮戊二酸脱羧生成琥珀酰辅酶A的酶系,由3种酶组成,即转琥珀酰酶、脱羧脱氢酶和二氢硫辛酰胺脱氢酶。α-酮戊二酸脱氢酶是三羧酸循环涉及到的酶中含量最低的酶,而且对氧化还原状态非常敏感,因此,α-酮戊二酸脱氢酶可能在调节三羧酸循环效率上起到关键作用。

测定原理:α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD+ 和辅酶A生成琥珀酰辅酶A、 二氧化碳和 NADH,NADH在340 nm有特征吸收峰,以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。

琥珀酸脱氢酶(SDH) 活性检测

测定意义:琥珀酸脱氢酶是线粒体内膜的结合酶,属于膜结合酶之一。琥珀酸脱氢酶是线粒体的一种标志酶,是连接氧化磷酸化与电子传递的枢纽之一,可为真核细胞线粒体和多种原核细胞需氧和产能的呼吸链提供电子,其活性一般可作为评价三羧酸循环运行程度的指标。

测定原理:SDH催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸,脱下的氢通过吩嗪二甲酯硫酸(PMS)传递还原2,6-二氯酚靛酚(DCPIP),并且在600nm处具有特征吸收峰,通过600nm吸光度的变化,测定2,6-DPIP的还原速度,代表SDH酶活性。

丙酮酸脱氢酶(PDH) 活性检测

测定意义:丙酮酸脱氢酶是糖酵解产物丙酮酸代谢为乙酰辅酶A的限速酶,该酶的活性降低将影响人体细胞葡糖糖的代谢利用,致使乳酸在体内堆积而诱发乳酸酸中毒。丙酮酸脱氢酶活性分析包括丙酮酸脱氢酶复合体DPN诱导分析法及14C标记丙酮酸同位素法两种。

测定原理:丙酮酸脱氢酶催化丙酮酸脱氢,同时还原2,6-二氯酚靛酚(2,6-DCPIP),从而导致600nm光吸收的减少。

总酸含量检测

测定意义:总酸存在于果蔬制品、饮料、乳制品、酒、蜂产品、淀粉制品、谷物制品和调味品等。总酸是指最终能释放出的氢离子数量。

测定原理:根据酸碱中和滴定原理,以酚酞为指示剂,用氢氧化钠标准溶液滴定供试品中的总酸。当溶液显红色并半分钟内不褪色指示反应终点,此时溶液pH为8.2,根据氢氧化钠标准溶液的消耗量计算供试品中的总酸含量。

三羧酸循环系列检测服务列表

可测物质 周期
柠檬酸(CA) 2-3
异柠檬酸 2-3
丙酮酸(PA) 2-3
乳酸 2-3
线粒体柠檬酸(MCA) 2-3
苹果酸 2-3
琥珀酸 2-3
α-酮戊二酸 2-3
草酰乙酸 2-3
2-磷酸甘油酸/3-磷酸甘油酸 2-3
葡萄糖腺苷二磷酸 2-3
DL-α-羟基戊二酸 2-3
乙醇酸 2-3
磷酸烯醇丙酮酸 2-3
6-磷酸葡萄糖酸酯 2-3
乙酰 2-3
磷酸二羟丙酮 2-3
3-磷酸甘油醛 2-3
3-磷酸甘油 2-3
丙二酰辅酶A 2-3
琥珀酰辅酶A 2-3
乙酰辅酶A 2-3
线粒体异柠檬酸脱氢酶(ICDHm) 2-3
α-酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH) 2-3
琥珀酸脱氢酶(SDH) 2-3
丙酮酸脱氢酶(PDH) 2-3
葡萄糖 2-3
4-磷酸-赤藓糖 2-3
1, 6-二磷酸果糖 2-3
1-磷酸果糖 2-3
6-磷酸果糖 2-3
1, 6-二磷酸葡萄糖 2-3
1-磷酸葡萄糖 2-3
6-磷酸葡萄糖 2-3
1-磷酸甘露糖 2-3
6-磷酸甘露糖 2-3
5-磷酸核糖 2-3
5-磷酸核酮糖 2-3
7-磷酸景天庚糖 2-3
二磷酸尿苷葡糖 2-3
5-磷酸木糖 2-3
NAD+ 2-3
NADH 2-3
NADP+ 2-3
NADPH 2-3
ATP 2-3
ADP 2-3
AMP 2-3
cAMP 2-3
GTP 2-3
GDP 2-3
UDP 2-3
其他三羧酸循环类物质 请联系技术支持181-0124-5990

HPLC测定三羧酸循环系列样本要求:
1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL,测定样品不返还,请您保留备份。

周期:2~3周

项目结束后迪信泰检测平台将会提供详细中英文双语技术报告,报告包括:
1. 实验步骤(中英文)
2. 相关质谱参数(中英文)
3. 质谱图片
4. 原始数据
5. 三羧酸循环系列含量信息

迪信泰检测平台可根据需求定制其他物质测定方案,具体请咨询技术支持181-0124-5990

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