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蛋白含量

蛋白质是由氨基酸以“脱水缩合”的方式组成的多肽链经过盘曲折叠形成的具有一定空间结构的物质。蛋白质是由α-氨基酸按一定顺序结合形成一条多肽链,再由一条或一条以上的多肽链按照其特定方式结合而成的高分子化合物。蛋白质就是构成人体组织器官的支架和主要物质,在人体生命活动中,起着重要作用,可以说没有蛋白质就没有生命活动的存在。

百泰派克检测平台采用考马斯亮蓝法、BCA法、双缩脲法对蛋白含量进行测定。

考马斯亮蓝法检测蛋白含量

测定意义:考马斯亮蓝法测定蛋白含量是染料结合法的一种。该方法灵敏度高,适合微量蛋白质分析。

测定原理:考马斯亮蓝在游离状态下呈红色,在稀酸溶液中与蛋白质的疏水区结合后变为青色,前者最大光吸收为465nm,后者最大光吸收为595nm。由于蛋白质与色素结合物在595nm处的吸光度与蛋白质含量成正比,所以可用于蛋白质的定量检测。

考马斯亮蓝G-250及其蛋白反应液吸收光谱扫描图
考马斯亮蓝G-250及其蛋白反应液吸收光谱扫描图

BCA法检测蛋白含量

测定意义:BCA蛋白法是近来应用最广泛的一种蛋白定量方法。该方法灵敏度高且不受绝大多数样品中的化学物质的影响。

测定原理:蛋白质在碱性环境下将二价铜离子还原成一价铜离子,BCA与一价铜离子相互作用生成紫蓝色络合物,其在562nm处有最大吸收峰,所以可用于蛋白质的定量检测。

双缩脲法检测蛋白含量

测定意义:双缩脲法测定蛋白含量是利用“双缩脲反应”原理,即双缩脲在强碱性条件下能与硫酸铜中的二价铜离子作用生成紫红色络合物。该方法测定范围为1~10mg蛋白质,适用于蛋白质浓度高的样品,尤其是动物材料。

测定原理:蛋白质及多肽的肽键与双缩脲结构相似,因此也能在强碱性条件下与硫酸铜中的二价铜离子作用生成紫红色络合物,其在540nm处有最大吸收峰,所以可用于蛋白质的定量检测。


样品制备

细胞样品处理方法:

1) 收集细胞;
2) 用磷酸缓冲液洗细胞3次;
3) 加入裂解缓冲液,室温振荡1 h,使其充分溶解;
4) 4℃,40000g,离心1 h;
5) 生化法检测蛋白含量。

植物组织样品处理方法:

1) 液氮研磨;
2) 植物组织悬浮于10%三氯醋酸和0.07% β-巯基乙醇的丙酮溶液在-20℃冰浴;
3) 沉淀过夜离心,弃上清;
4) 重悬沉淀于含0.07% β-巯基乙醇的冰预冷丙酮溶液;
5) 离心后真空干燥沉淀;
6) 裂解离心;
7) 生化法检测蛋白含量。

动物组织样品处理方法:

1) 液氮研磨,每1 g样品加入0.5 mL裂解液;
2) 组织匀浆器匀浆30 s;
3) 组织悬液15℃,10000 g离心10 min;
4) 上清液4℃,150000g超速离心45℃;
5) 避开上层漂浮的脂质层,吸取离心上清6℃,40000g,离心50 min;
6) 生化法检测蛋白含量。

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